рефераты, курсовые, дипломы >>> биология, химия

 

История и методология клонирования

 

История и методология клонирования

Эта тема замечательно отражена в статье Конюхова Бориса Владимировича - доктора биологических наук, заведующего лабораторией генетики развития Института общей генетики имени Н.И. Вавилова. Тут я просто приведу ее текст :

Долли - случайность либо закономерность?

Термин "клон" происходит от греческого слова "klon", что значит - веточка, побег, черенок, и имеет отношение до этого всего к вегетативному размножению. Клонирование растений черенками, почками либо клубнями в сельском хозяйстве, в частности в садоводстве, понятно уже более 4-х тыс. Лет. Начиная с 70-х годов нашего столетия для клонирования растений стали обширно употреблять небольшие группы и даже отдельные соматические (неполовые) клеточки.

Дело в том, что у растений (в различие от животных) по мере их роста в ходе клеточной специализации - дифференцировки - клеточки не теряют так называемых тотипотентных параметров, т.Е. Не теряют собственной способности реализовывать всю генетическую информацию, заложенную в ядре. Поэтому фактически неважно какая растительная клеточка, сохранившая в процессе дифференцировки свое ядро, может дать начало новому организму. Эта изюминка растительных клеток лежит в базе многих способов генетики и селекции.

При вегетативном размножении и при клонировании гены не распределяются по потомкам, как в случае полового размножения, а сохраняются в полном составе в течение многих поколений. Все организмы, входящие в состав определенного клона, имеют однообразный набор генов и фенотипически не различаются меж собой.

клеточки животных, дифференцируясь, лишаются тотипотентности, и в этом - одно из существенных их различий от клеток растений. Как будет показано ниже, конкретно тут - основное препятствие для клонирования взрослых позвоночных животных.

Первые опыты на амфибиях

Возможность клонирования зародышей позвоночных в первый раз была показана в начале 50-х годов в опытах на амфибиях. Американские исследователи Бриггс и Кинг разработали микрохирургический способ пересадки ядер эмбриональных клеток с помощью узкой стеклянной пипетки в лишенные ядра (энуклеированные) яйцеклетки [1]. Они установили, что если брать ядра из клеток зародыша на ранешней стадии его развития - бластуле, то приблизительно в 80% случаев зародыш благополучно развивается дальше и преобразуется в обычного головастика. Если же развитие зародыша, донора ядра, продвинулось на следующую стадию - гаструлу, то только менее чем в 20% случаев оперированные яйцеклетки развивались нормально. Эти результаты позднее были доказаны и в остальных работах.

Большой вклад в эту область внес английский биолог Гердон. Он первым в опытах с южноафриканскими жабами Xenopus laevis (1962) в качестве донора ядер употреблял не зародышевые клеточки, а уже вполне специализировавшиеся клеточки эпителия кишечника плавающего головастика [2]. Ядра яйцеклеток реципиентов он не удалял хирургическим методом, а разрушал ультрафиолетовыми лучами. В большинстве случаев реконструированные яйцеклетки не развивались, но приблизительно десятая часть их них образовывала эмбрионы. 6,5% Из этих зародышей достигали стадии бластулы, 2,5% - стадии головастика и лишь 1% развился в половозрелых особей (рис. 1). Но появление нескольких взрослых особей в таковых условиях могло быть связано с тем, что посреди клеток эпителия кишечника развивающегося головастика достаточно долгое время находятся первичные половые клеточки, ядра которых могли быть использованы для пересадки. В последующих работах как сам автор, так и многие остальные исследователи не смогли подтвердить данные этих первых опытов.

позднее Гердон модифицировал опыт [3]. Поскольку большая часть реконструированных яйцеклеток (с ядром клеточки кишечного эпителия) погибают до завершения стадии гаструлы, он попробовал извлечь из них ядра на стадии бластулы и опять пересадить их в новейшие энуклеированные яйцеклетки (таковая процедура именуется "серийной пересадкой" в различие от "первичной пересадки"). Число эмбрионов с обычным развитием после этого увеличивалось, и они развивались до более поздних стадий по сравнению с зародышами, полученными в итоге первичной пересадки ядер.

потом Гердон совместно с Ласки (1970) стали культивировать in vitro (вне организма в питательной среде) клеточки почки, легкого и кожи взрослых животных и употреблять уже эти клеточки в качестве доноров ядер [4]. приблизительно 25% первично реконструированных яйцеклеток развивались до стадии бластулы. При серийных пересадках они развивались до стадии плавающего головастика. Таковым образом было показано, что клеточки трех различных тканей взрослого позвоночного (X. laevis) содержат ядра, которые могут обеспечить развитие по крайней мере до стадии головастика.

В сною очередь ДиБерардино и Хофнер употребляли для трансплантации ядра недслящихся и полносгью дифференцированных клеток крови - эритроцитов лягушки Rana pipiens [5]. После серийной пересадки таковых ядер 10% реконструированных яйцеклеток достигали стадии плавающего головастика. Но даже с помощью многократных серийных пересадок (более 100 клеточных циклов) реконструированные яйцеклетки дальше стадии головастика не развивались.

таковым образом, во многих работах показано, что в случае амфибий донорами ядер могут быть только зародыши на ранешних стадиях развития. Некие авторы называют подобные опыты клонированием амфибий, хотя правильнее именовать их клонированием зародышей амфибий, так как в этом случае мы размножаем бесполым методом не взрослых животных, а эмбрионов.

Дифференцировка клеток в ходе развития позвоночных сопровождается инактивацией неработающих генов. Поэтому клеточки теряют тотипотентность, дифференцировка становится необратимой. В конце концов у одних клеток происходит полное репрессирование генома, у остальных - в той либо другой степени деградирует ДНК, а в неких вариантах разрушается даже ядро. Но наряду с дифференцированными кочетками культивируемые in vitro клеточные популяции содержат малодифференцированные стволовые клеточки, которые и могут быть использованы как доноры ядер для клонирования млекопитающих.

Опыты с амфибиями проявили, что ядра разных типов клеток одного и того же организма генетически идентичны и в процессе клеточной дифференцировки равномерно теряют способность обеспечивать развитие реконструированных яйцеклеток, но серийные пересадки ядер и культивирование клеток in vitro в какой-то степени увеличивает эту способность.

Неудачи экспериментов с мышами

удачные опыты с амфибиями принудили ученых задуматься о клонировании зародышей млекопитающих, в частности мышей. МакКиннел в одной из собственных работ отмечал, что все нужные для этого способы уже есть, и непонятно, почему мышь до сих пор не клонирована. По его мнению, первыми объектами обязаны были стать конкретно маленькие животные, такие как мышь либо кролик. Но предсказание МакКиннелла не сбылось, хотя в конце 70-х годов опыты на мышах вправду начались и протекали очень драматично. К тому времени, замечу, очень основательно были исследованы биология и генетика ранешних этапов развития млекопитающих, и, в частности, мыши как модельного объекта.

Работа методически оказалась достаточно трудной, до этого всего потому, что размер яйцеклетки у млекопитающих приблизительно в тыщу раз меньше, чем у амфибий. Но эти трудности были удачно преодолены. Экспериментаторы научились микрохирургически удалять пронуклеусы [6] из зигот (оплодотворенных яйцеклеток) мыши и пересаживать в них клеточные ядра ранешних зародышей. Но все полученные различными методами зародыши мышей развивались только до стадии бластоцисты [7].

6. Пронуклеус - одно из двух гаплоидных ядер в яйце млекопитающих в период после проникания сперматозоида, но до слияния мужского и дамского пронуклеусов в ядро зиготы в процессе осеменения. Мужское ядро формируется из ядерного материала сперматозоида, женское - из хромосом яйцеклетки.

7. Бластоциста (бластула) - зародыш млекопитающих на одной из ранешних стадий развития, еще до его имплантации в матку.

В 1977 году возникло сенсационное сообщение Хоппе и Илменси о том, что они получили семь взрослых самок мышей, пять из которых имели голько магеринский, а две - отцовский геном [8]. Это, типо, зависело от гого, какой пронуклеус был оставлен в яйце - дамский либо мужской, он и определял развитие особи но типу гиногенеза либо андрогенеза. Их фуррор был связан, но описанию авторов, с гем, что, удаляя один нронуклеус, они удваивали число хромосом другого, обрабатывая яйца особым веществом, потом выращивали полученные диплоидные гомочиготные (с двумя одинаковыми наборами генов) зародыши in vitro до стадии бластоцисты и пересаживали в матку самки-реципиента для дальнейшего развития.

Казалось, сейчас можно будет скоро получать млекопитающих со 100%-ной гомозиготностью по всем генам. Это в особенности принципиально в селекции, так как для получения сельскохозяйственных животных, в частности, крупного рогатого скота, с закрепленными особо ценными свойствами обыденными приемами требуются десятки лет работы.

но, к огорчению, данные Хоппе и Илменси подтвердить не удалось, хотя многие пробовали это сделать. Оказалось, что полученные хоть каким методом диплоидные андрогенетические и гиногенетические зародыши мышей погибают на тех же стадиях, что и диплоидные партеногенетические (развивающиеся из неоплодотворенной яйцеклетки) эмбрионы.

существенно усовершенствовав способы извлечения ядер и введения их в клеточку, МакГрат и Солтер провели свою серию экспериментов и сказали, что высокий выход живых мышей они получили, когда в качестве доноров ядер употребляли зиготы, но если донорами были ранешние эмбрионы, то реконструированные яйцеклетки, как и до этого, развивались лишь до стадии бластоцисты [9].

способ МакГрата и Солтера стал обширно употребляться различными экспериментаторами. Так, Манн и Ловел-Бадж выделяли пронуклеусы из яиц, активированных к партеногенезу, и пересаживали их энуклеированные зиготы мышей [10]. В этих вариантах эмбрионы погибали на ранешних стадиях. Если же напротив, пронуклеусы получали из оплодотворенных яиц и пересаживали в партеногенетически активированные и лишенные ядра яйца, то такие зародыши развивались нормально до рождения. Сурани с соавторами установили, что если добавить дамский пронуклеус из зиготы мыши к гаплоидному набору хромосом яйцеклетки, то обычного развития не происходит, добавление же мужского ядра приводит к нормальному развитию [11]. С другой стороны, рекомбинации мужского и дамского пронуклеусов из различных оплодотворенных яйцеклеток мышей обеспечивает обычное развитие, а композиция двух мужских либо двух дамских пронуклеусов останавливает развитие эмбриона [12].

Эти опыты проявили, что для обычного развития млекопитающих требуются два комплекса хромосом - отцовский и материнский. Поэтому ни у одного из узнаваемых видов млекопитающих не описан партеногенез. Поэтому работы Хоппе и Илменси не удалось повторить.

но эти исследователи еще дважды будоражили научное общество. В 1982 году они пересадили ядра клеток партеногенетических бластоцист мышей в энуклеированные зиготы некие из этих реконструированных яйцеклеток нормально развивались, и типо были получены четыре взрослых самки. В свете вышесказанного эти результаты очень маловероятны.

смерть партеногенетических (гиногенетических) и андрогенетических эмбрионов у млекопитающих связана с различной активностью в онтогенезе материнского и отцовского геномов. Механизм, регулирующий эти функциональные различия, был назван геномным импринтингом [13] и изучался в ряде работ, где было показано, что для обычного развития млекопитающих требуется наличие мужского генома. Другая статья Илменси и Хоппе [14] имела еще больший резонанс.

Авторы сказали о пересадке ядер клеток внутренней клеточной массы бластоцисты в энуклеированные зиготы мышей и получении трех взрослых мышей (двух самок и самца), генетически идентичных донорской полосы мышей. Введение ядер-доноров и удаление пронуклеусов из зиготы проводили за один прием, потом реконструированные яйцеклетки культивировали in vitro до стадии бластоцисты и пересаживали в матку самок. Из 16-ти пересаженных бластоцист три развились во взрослых животных. В следующей работе (1982) эти же авторы употребляли в качестве доноров ядер клеточки зародышей еще более поздних стадий (7 суток) и будто бы получили трех половозрелых мышей. Но никто из работающих в том же направлении не сумел добиться схожих результатов, и достоверность данных Илменси и Хоппе была вновь поставлена под колебание.

МакГрат и Солтер проявили, что ядра 8-клеточных эмбрионов и клеток внутренней клеточной массы бластоцисты не обеспечивают развитие in vitro реконструированных яйцеклеток даже до стадии морулы, которая предшествует стадии бластоцисты [15]. маленькая часть (5%) ядер 4-клеточных эмбрионов дает возможность развиваться лишь до стадии морулы. В то же время 19% реконструированных яйцеклеток, содержащих ядра 2-клеточных эмбрионов, смогли достичь стадии морулы либо бластоцисты.

Эти и многие остальные данные показывают, что в эмбриогенезе у мышей клеточные ядра рано теряют тотипотентность, что связано разумеется, с совсем ранешней активацией генома зародыша - уже на стадии 2-х клеток. У остальных млекопитающих, в частности, у кроликов, овец и крупного рогатого скота, активация первой группы генов в эмбриогенезе происходит позже, на 8-16-клеточной стадии. Может быть поэтому первые значимые успехи в клонировании зародышей были достигнуты на остальных видах млекопитающих, а не на мышах. Тем не менее, работы с мышами, несмотря на их непростую судьбу, существенно расширили наши представления о методологии клонирования млекопитающих.

Кролики, скотины и свиньи

Американские исследонатели Стик и Робл, используя методику МакГрата и Солтера, получили 6 живых кроликов, пересадив ядра 8клеточных зародышей одной породы в лишенные ядра яйцеклетки кроликов другой породы [16]. Фенотип родившихся полностью соответствовал фенотипу донора.

но лишь 6 из 164 реконструированных яйцеклеток (3,7%) развились в обычных животных. Это, естественно, совсем маленький выход, фактически не позволяющий рассчитывать на получение таковым способом клона генетически идентичных животных. Ценность данной работы тем не менее в том. Что она показала возможность клонирования зародышей кроликов.

Работа с реконструированными яйцеклетками больших домашних животных, скотин либо овец, идет несколько по-другому. Их поначалу культивируют не in vitro, a in vivo - в перевязанном яйцеводе овцы - промежуточного (первого) реципиента. Потом их оттуда вымывают и трансплантируют в матку окончательного (второго) реципиента - скотины либо овцы соответственно, где их развитие происходит до рождения детеныша. Уиладсин предложил заключать реконструированные яйцеклетки в агаровый цилиндр, который он потом трансплантировал в перевязанный яйцевод овцы [17]. По данным одних авторов реконструированные зародыши лучше развиваются в яйцеклетке, чем в культуральной среде, хотя некие исследователи получили неплохие результаты и при культивировании.

Американцы Робл и его сотрудники, используя щадящий способ извлечения ядра без прокалывания мембраны яйцеклетки, предложенный МакГратом и Солтером, пересаживали в зиготы так называемые кариопласты - мужской и дамский пронуклеусы совместно с окружающей их цитоплазмой, а также ядра 2-, 4- либо 8-клеточных эбрионов скотины [18]. поначалу зиготы центрифугировали чтоб высвободить пронуклеусы от окружающих их гранул желтка, после чего ядра были отлично видны под микроскопом (рис. 2А), что существенно облегчало их удаление (рис. 2Б). При помощи манипулятора и заостренной стеклянной микропипетки извлекали один из бластомеров совместно с ядром из ранешних эмбрионов (рис. 2В) и переносили его в энуклеированную зиготу (рис. 2Г).

Реконструированные зародыши были заключены в агаровый цилиндр и пересажены в перевязанный яйцевод овцы. Через пять дней культивирования их вымывали, освобождали от агара и изучили. Реконструктурированные зародыши в данной работе развивались лишь в тех вариантах, когда в зиготы пересаживали пронуклеусы: 17% таковых эмбрионов достигли стадии морулы либо бластоцисты. Два зародыша были пересажены второму реципиенту - в матку скотины, и развитие их завершилось рождением живых телят. Если в качестве доноров употребляли ядра 2-, 4- либо 8-клеточных эмбрионов, то реконструированные яйцеклетки не развивались даже до стадии морулы.

позднее были и более удачные работы. Уиладсин, в частности. Сказал, что ему удалось получить четырех генетически идентичных бычков холстейнской породы в итоге пересадки в реципиентные яйцеклетки ядер бластомеров одного 32-клеточного зародыша [19] (рис. 3). Автор утверждал, что большая часть ядер сохраняет тотипотентность на 32-клеточной стадии, а значимая их часть даже на 64-клеточной стадии, обеспечивая обычное развитие реконструированных яйцеклеток до стадии ранешней бластоцисты в яйцеводе овцы. После пересадки в матку скотин - окончательных реципиентов, как полагает автор, они могут и дальше нормально развиваться.

Бондиоли и соавторы, используя в качестве доноров ядер 16-64-клеточные зародыши скотин, трансплантировали 463 реконструированных зародыша в матку синхронизированных реципиентов, и было получено 92 живых теленка [20]. Семь из них были генетически идентичны, представляя собой клон, полученный в итоге пересадки ядер клеток одного донорского эмбриона.

таковым образом, клеточные ядра эмбрионов крупного рогатого скота довольно долго сохраняют тотипотентность и могут обеспечить полное развитие реконструированных яйцеклеток. По другому говоря, методические трудности клонирования эмбрионов крупного рогатого скота фактически решены. Но остается основная задачка - отыскать донорские ядра, владеющие тотипотентностью, для клонирования взрослых животных.

Клонированию зародышей свиней посвящена лишь одна маленькая работа [21]. Скудность данных, видимо.И связана с определенными трудностями работы с этим объектом.

Клонирование овец

Уиладсин еще в 1986 году показал, что и у зародышей овец на 16-клеточной стадии развития ядра сохраняют тотипотентность [22]. Реконструированные яйцеклетки, содержащие ядра бластомеров 16-клеточных эмбрионов, развивались нормально до стадии бластоцисты в перевязанном яйцеводе овцы (в агаровом цилиндре), а после освобождения от агара и пересадки в матку овцы - второго реципиента - еще 60 дней. В другом случае донорами служили ядра 8-клеточных эмбрионов и были получены 3 живых ягненка, фенотип которых соотнетстиовал породе овец - доноров.

В 1989 году Смит и Уилмут трансплантировали ядра клеток 16-клеточного эмбриона и ранешней бластоцисты в лишенные ядра неоплодотворенные яйцеклетки овец [23]. В первом случае было получено два живых ягненка, фенотип которых соответствовал породе овец - доноров ядер. Во втором случае один полностью сформировавшийся ягненок умер во время родов. Его фенотип также соответствовал породе - донору. Авторы считали, что в ходе дифференцировки эмбриональных клеток происходит инактивация неких принципиальных для развития генов, в итоге которой ядра бластоцисты уже не могут репрограммироваться в цитоплазме яйцеклетки и обеспечить обычное развитие реконструированного зародыша. Поэтому, по мнению авторов, в качестве доноров ядер лучше употреблять 16-клеточные эмбрионы либо культивируемые in vitro полосы эмбриональных клеток, ядра которых владеют тотипотентностью.

позже, в 1993-1995 годах, группа исследователей под управлением Уилмута получила клон овец - 5 идентичных животных, донорами ядер которых была культура эмбриональных клеток [24]. Клеточную культуру получали следующим образом: выделяли микрохирургически эмбриональный диск из 9-дневного овечьего эмбриона (бластоцисты) и культивировали клеточки in vitro в течение многих пассажей (по крайней мере до 25). поначалу клеточная культура напоминала культуру стволовых недифференцированных эмбриональных клеток, но скоро, после 2-3-х пассажей, клеточки становились уплотненными и морфологически сходными с эпителиальными. Эта линия клеток из 9-дневного зародыша овцы была обозначена как TNT4.

чтоб донорское ядро и реципиентная цитоплазма находились на сходных стадиях клеточного цикла, останавливали деление культивируемых клеток TNT4 на определенной стадии (GO) и ядра этих клеток пересаживали в энуклеированные яйцеклетки (соответственно на стадии метафазы II). Реконструированные эмбрионы заключали в агар и трансплантировали в перевязанные яйцеводы овец. Через 6 дней эмбрионы вымывали из яйцевода первого реципиента и изучили под микроскопом. Отбирали те, которые достигли стадии морулы либо бластоцисты и пересаживали их в матку овцы - окончательного реципиента, где развитие длилось до рождения. Родилось 5 ягнят (самок) из них 2 погибли скоро после рождения, 3-й в возрасте 10 дней, а 2 оставшихся нормально развивались и достигли 8-9-месячного возраста. Фенотипически все ягнята были сходны с породой овец, от которой получали начальную линию клеток TNT4. Это подтвердил и генетический анализ.

Эта работа, в особенности в части культуры эмбриональных клеток, - существенное достижение в клонировании млекопитающих, хотя она и не вызвала столь шумного энтузиазма, как статья того же Уилмута с соавторами, опубликованная в начале 1997 года, где сообщалось, что в итоге использования донорского ядра клеточки молочной железы овцы было получено клональное животное - овца по кличке Долли [25]. Последняя работа методически во многом повторяет предыдущее исследование 1996 года, но в ней ученые употребляли не лишь эмбриональные, но еще и фибробластоподобные клеточки (фибробласты - клеточки соединительной ткани) плода и клеточки молочной железы взрослой овцы. Клеточки молочной железы получали от шестилетней овцы породы финн дорcет, находящейся на последнем триместре беременности. Все три типа клеточных культур имели однообразное число хромосом - 54, как традиционно у овец. Эмбриональные клеточки употребляли в качестве доноров ядер на 7-9-м пассажах культивирования, фибробластоподобные клеточки плода - на 4-6-м пассажах и клеточки молочной железы - на 3-6-м пассажах. Деление клеток всех трех типов останавливали на стадии GO и ядра клеток пересаживали в энуклеированные ооциты (яйцеклетки) на стадии метафазы II. Большая часть реконструированных зародышей поначалу культивировали в перевязанном яйцеводе овцы, но некие и in vitro в химически определенной среде. Коэффициент выхода морул либо бластоцист при культивировании in vitro в одной серии опытов был даже вдвое выше, чем при культивировании в яйцеводе. (Поэтому, видимо, нет строчки необходимости в промежуточном реципиенте и можно обойтись культивированием in vitro. Но для полной уверенности в этом необходимы дополнительные данные.)

Выход морул либо бластоцист в серии опытов с культурой клеток молочной железы был приблизительно втрое меньше, чем в двух остальных сериях, когда в качестве доноров ядер употребляли культуру фибробластов плода либо эмбриональных клеток. Число живых ягнят в сравнении с числом пересаженных в матку окончательного реципиента морул либо бластоцист было также в два раза ниже. В серии опытов с клеточками молочной железы из 277 реконструированных яйцеклеток был получен лишь один живой ягненок, что говорит об совсем низкой результативности такового рода экспериментов (0,36%). Анализ генетических маркеров всех семи родившихся в трех сериях экспериментов живых детенышей показал, что клеточки молочной железы были донорами ядер для одного, фибробласты плода - для двух и эмбриональные клеточки - четырех ягнят. Овца по кличке Долли развилась из реконструированной яйцеклетки, донором ядра которой была культивируемая клеточка молочной железы овцы породы финн дорсет и фенотипически не различается от овец данной породы, но сильно различается от овцы-реципиента. Анализ генетических маркеров подтвердил этот итог.

фуррор авторов данной работы до этого всего связан с внедрением долгих клеточных культур, так как после многих пассажей в культуре клеток могли быть отобраны малодифференцированные стволовые клеточки, которые, возможно, и были использованы как доноры ядер. Огромное значение также имел тот факт, что авторы, беря во внимание результаты собственных прошлых работ, синхронизировали стадии клеточного цикла яйцеклеток реципиентов и клеток доноров.

Заключение

Итак, работы по клонированию позвоночных были начаты на амфибиях в начале 50-х годов и интенсивно длятся вот уже более четырех десятилетий. Что касается амфибий, то, как было сказано в соответствующем разделе, несмотря на значимые заслуги, неувязка клонирования взрослых особей остается до сих пор не решенной. Установлено, что в ходе клеточной дифференцировки у позвоночных происходит либо утрата определенных генных локусов либо их необратимая инактивация. Судя по всему, утрачивается та часть генома, которая контролирует не ранешние, а более поздние этапы онтогенеза, в частности, метаморфоз амфибий. Механизм этого явления пока не поддается научному объяснению. Но разумеется, что для клонирования взрослых позвоночных нужно употреблять малодифференцированные делящиеся клеточки. Это методически принципиальное положение было учтено в более поздних работах.

В 1979 году американский биолог МакКиннел, внесший большой вклад в работу с амфибиями, утверждал, что полученные результаты не разрешают серьерно говорить о способности клонирования человека [26] - тогда это казалось недоступным для экспериментальных эмбриологов. Но еще в то время многие ученые, писатели и даже политики стали активно обсуждать возможностт клонирования человека, а некие исследователи даже приступили к таковым экспериментам. К примеру, Шеттлз сказал, что пересадил ядро сперматогониальной клеточки (диплоидного предшественника зрелого гаплоидного спермия) в лишенную ядра яйцеклетку человека [27]. В итоге три реконструированные яйцеклетки начали дробление, и появились похожие на морулы скопления клеток, которые позже деградировали. Шеттлз полагал, что если трансплантировать такие группы клеток в матку дамы, то они могли бы нормально развиваться. МакКиннел тогда справедливо возразил, что такое предположение маловероятно и совсем неоправданно.

Еще 5-6 лет назад никто из ученых, а их работало достаточно много в данной области, не ставил вопрос об использовании в качестве доноров ядер клеток взрослых млекопитающих. Работы сводились, в основном, к клонированию зародышей домашних животных, и многие из этих исследований были не совсем успешны. Поэтому так поразило появившееся в начале 1997 года неожиданное для всех сообщение авторского коллектива под управлением Уилмута, что им удалось, используя соматические клеточки взрослых животных, получить клональное животное - овцу по кличке Долли. На самом деле, но, исследователи прошли долгий путь, и Уилмуту с сотрудниками пришлось собрать воедино все существовавшие к тому времени заслуги, до этого чем они смогли сказать о сенсационном итоге собственной работы.

У этого первого удачного опыта есть значимый недочет - совсем маленький коэффициент выхода живых особей (0,36%), и если учитывать также высокий процент смерти развивающихся реконструированных яйцеклеток в плодный период развития (62%), который в 10 раз выше, чем при обычном скрещивании (6%), то встает вопрос о причинах смерти эмбрионов. Все ли пересаженные донорские ядра владели тотипотентностью? Сохранялся ли полностью их функциональный геном (набор генов, нужных для развития), все ли нужные для развития гены были дерепрессированы? Это совсем принципиальные вопросы, и по одному животному нельзя сделать окончательные выводы. Тем более, что результаты исследований на амфибиях молвят о необратимом характере инактивации, репрессии генов в ходе клеточной дифференцировки. Может быть, авторам крупно подфартило, и они довольно случаем в трех различных клеточных популяциях отобрали за маленький срок стволовые клеточки, для которых характерна низкая дифференцированность и способность к делению. Чтоб подтвердить итог данной, в буквальном смысле слова с.Енсационной работы, необходимы дополнительные исследования.

В наиблежайшие годы основная задачка исследователей, работающих в данной области - это, по-видимому, создание культивируемых in vitro линий малодифференцированных стволовых клеток, характеризующихся высокой скоростью деления. Ядра конкретно таковых клеток обязаны обеспечить полное и обычное развитие реконструированных яйцеклеток, формирование не лишь морфологических признаков, но и обычных функциональных черт клонированного организма.

Исследования Уилмута и служащих имеют не лишь практическое, но и огромное научное значение для генетики развития. В сущности, они нашли условия, при которых цитоплазма ооцитов млекопитающих может репрограммировать ядро соматической клеточки, возвращая ей тотипотентность. После публикации данной работы сходу и обширно стал дискутироваться вопрос о способности клонирования человека. Чтоб его обсуждать, имеет смысл выделить два аспекта: методический и этический.

Из изложенного выше следует, что методически либо технически клонирование взрослых млекопитающих создано еще недостаточно, чтоб можно было уже сейчас ставить вопрос о клонировании человека. Для этого нужно расширить круг исследований, включив в него. Не считая овец. Представителей и остальных видов животных. Уилмут с сотрудниками, к примеру, планирует продолжить свои работы на коровах и свиньях. Такие работы необходимы, чтоб установить, не ограничивается ли возможность клонирования взрослых млекопитающих чертами либо спецификой какого-или одного либо нескольких видов.

потом нужно значительно повысить выход жизнеспособных реконструированных зародышей и взрослых клонированных животных, выяснить, не влияют ли методические приемы на длительность жизни, функциональные характерстики и плодовитость животных. Для клонирования человека совсем принципиально свести к минимуму риск, который, тем не менее, в определенной степени все равно остается, риск дефектного развития реконструированной яйцеклетки, главной предпосылкой которого может быть неполное репрограммирование генома донорского ядра.

Что касается этической строны дела, клонирование человека вызывает еще больше возражений. Во-первых, становление человека как личности, базируется не лишь на биологической наследственности, оно определяется также домашней, социальной и культурной средой. При клонировании индивидума нереально воссоздать все те условия воспитания и обучения, которые сформировали личность его прототипа (донора ядра). Во-вторых, при бесполом размножении вначале твердая запрограммированность генотипа предопределяет меньшее обилие взаимодействий развивающегося организма с изменяющимися условиями среды (по сравнению с половым размножением, когда в формировании индивидума участвуют два генома, сложным и непредсказуемым образом взаимодействующие меж собой и с окружающей средой). В третьих, фактически все религиозные учения настаивают, что появление человека на свет - в "руках" высших сил, что зачатие и рождение обязано происходить естественным методом.

Подводя итоги, следует признать, что говорить о клонировании человека можно только сугубо теоретически. В сущности речь идет даже не о клонировании, а о получении копии отдельного индивидума, поскольку термин "клонирование" предполагает получение некоего множества особей. Но слово уже прижилось, поэтому имеет смысл воспользоваться им по прежнему. Разумеется, что сейчас возможность отрицательных последствий данной процедуры существенно перевешивает её выгоды, поэтому, по моему глубочайшему убеждению, работы по клонированию человека, как в настоящее время, так и в ближнем будущем проводить нецелесообразно.

может быть, через какое-то время, когда будут усовершенствованы все этапы этого сложного биотехнологического способа, ученые, социологи и остальные заинтригованные лица сумеют возвратиться к дискуссии целесообразности клонирования человека. Но это время, думаю, наступит не скоро, и в любом случае решение вопроса о клонировании того либо другого человека будет регламентироваться серьезными рамками и правилами, касаясь, может быть, лишь неких медицинских заморочек, скажем непреодолимого другими способами бесплодия.

В то же время, работы с домашними животными совсем важны с практической точки зрения. Клонирование ценных трансгенных животных может скоро и экономично обеспечить человечество новыми лекарственными продуктами, содержащимися в молоке, специально полученных для этого генноинженерными способами овец, коз либо скотин. Клонирование высокопродуктивных домашних животных, в частности, молочных скотин, может произвести практически революцию в сельском хозяйстве, так как лишь этим способом можно сделать не отдельные экземпляры, а целые стада элитных скотин рекордисток. Это же относится к размножению выдающихся спортивных лошадей, ценных пушных зверей, сохранению редких и исчезающих животных в природных популяциях и т.Д.

новейшие технологии, без сомнения, приносят пользу человечеству, и их нужно всячески поощрять. Запреты необходимы в тех крайних вариантах, когда очевидно просматривается вред либо вред для здоровья и благополучия людей. Пока клонирование человека можно отнести к этому уровню. Нравственная сторона трудности, тем не менее, уже стоит в полный рост. Безудержно оптимистическую позицию, как мне представляется, занимают лишь люди, плохо понимающие вопрос. Тем, кто знает его, ясно: переносить еще не решенную методически научную разработку на человека безнравственно. Федерация научных обществ экспериментальных биологов США - а это более 52 тыс. Членов - в октябре 1997 года объявила пятилетний мораторий на опыты по клонированию человека. Ведь они подразумевают роль множества конкретных людей, которые захочут дать свои клеточки, и суррогатных матерей, которые обязаны будут выносить плод. А если так велико количество повреждений зародышей и мертворождений, если неясен вообще конечный итог, этично ли даже говорить о переносе опыта на живых людей? Более того, найдутся безнравственные люди, которые под маркой помощи бесплодным парам, к примеру, начнут выманивать огромные средства, что скомпрометирует саму идею, научный поиск.

Я совсем не отрицаю того, что в будущем, когда неувязка будет полностью решена методически, человечество признает клонирование как способ помощи бесплодным парам, стремящимся иметь родного им дитя. Хотя говорить, быстрее, нужно будет не о ребенке как таковом, а об однояйцевом близнеце отца либо матери, каким будет клонированный ребенок в биологическом смысле. Но тогда тем более будет нужно заблаговременно решить этические и юридические вопросы, как это было для трансплантации органов во многих странах мира. Нормы биоэтики выдвигаются сейчас на первый план. Те нравственные заповеди, которыми человечество пользуется века, к огорчению, не предугадывают новейших закономерностей и возможностей, какие вносит в жизнь наука. Поэтому людям и нужно обсуждать и воспринимать новейшие законы общежития, учитывающие новейшие действительности.

копии с изменённой ДНК.

Ну вот и случилось то, чего так долго ждали и чего некие так боялись. Возникло сообщение, что ученым из уже известной собственной овцой Долли шотландской компании PPL Therapeutics (коммерческого отделения Розлин Института в Эдинбурге) удалось получить удачные копии овечек с измененной ДНК. Шотландские ученые смогли выполнить клонирование, при котором генетический материал клона был "подправлен" с лучшую сторону.

Но до этого чем продолжать трубить в фанфары, незначительно истории.

Если помните, все началось с овечки Долли, которая была клонирована в 1996 году учеными из той же шотландской лаборатории, что и сегодняшние овечки. Термин "клонирование" значит выкармливание из соматической, неполовой клеточки чёткой генетической копии матери. Клеточка взрослой овцы сливалась с взятой у другой овцы яйцеклеткой, из которой предварительно было удалено ядро, содержащее наследственную информацию. Цитоплазма яйцеклетки и ядро взрослой клеточки соединялись в своеобразное подобие оплодотворенной яйцеклетки. Из нее выращивался эмбрион, который уже имплантировался третьей овце. То есть в случае с Долли был "обойден" половой процесс и сплетенная с ним роль варианта при комбинировании наследственных задатков. К примеру, у Долли - белая морда финско-дорсетской породы (от генетической матери), хотя она была выношена черномордой шотландской броской. После этого открытия начались бессчетные случаи "другого" клонирования-копирования. Многие из них, при том же заглавии, тем не менее не повторяют опыта с Долли.

Есть до сей поры несколько заморочек, связанных с Долли. Первая, судя по всему, удачно разрешена. Она заключалась в том, что Долли была не единственным клоном, полученным шотландскими учеными. Клонов было несколько десятков. В живых осталась лишь одна Долли. Но за четыре года, прошедших с её рождения, судя по всему, ученым удалось так отточить технику клонирования, что брак стал минимальным. Пишу так осторожно, потому что не встречал конкретных цифр смертности разных клонов. Это понятно - кто же захотит расписывать собственные неудачи. Но, по косвенным данным, даже если брак и существует, то он не так велик, как в случае с Долли. (Судя по сообщениям информационных агентств, в нынешнем опыте было имплантировано 80 зародышей, из них 14 родилось, три овцы дожили до шестимесячного возраста. Итог намного лучше, чем с Долли.)

Вторая неувязка еще серьезней и масштабней, с научной точки зрения. Несмотря на все победные фанфары в случае с Долли, до сих пор неясным остается её возраст и связанные с ним трудности. Дело в том, что, может быть, возраст шестилетней матери так сильно "запечатлелся" в её клеточках, что при рождении Долли УЖЕ была немолодой особой. Поэтому так принципиальна была еще одна попытка ученых сотворить по методике копирования Долли кого-нибудь другого.

В случае работы доктора Чикара Кубота из Kogashima Cattle Breeding Development Institute и доктора Джерри Янга из Animal Transgenic Facility института Коннектикута это были клеточки из ушной раковины 17-летнего призового быка, из которых вышло шесть телят. В декабре 1997 года Янг и Кубота взяли эталоны клеток и поместили их в питательную среду, причем было остановлено их деление. Потом с клеточками была проделана таковая же операция, что и с Долли. Но! Пересадка ядра с генетической информацией была осуществлена не сходу, а спустя два месяца в одном случае и через три месяца в другом. Четыре теленка родились в декабре 1998 года, два - в феврале 1999 года. Причем, чем больше клеточки "мариновались" в пробирке, тем стремительней было их развитие во чреве матери. Таковым образом, ученым удалось показать, что возможен и не смертелен перерыв в "сборе" и "пересаживании" клеток к приемной матери.

Этот опыт интересен и тем, что, как уже сейчас стало ясно, биологический возраст бычков из ушной раковины молодее, чем обязан был быть и неувязка с биологическим возрастом клона разрешена теоретически. Осталось лишь подобрать ей надежное практическое решение.

Вот таковым "поле битвы" научных открытий и идей было до недавнего времени. На этом фоне шотландские ученые сделали еще один, революционный, шаг вперед. Что им удалось и что вышло?

На последний вопрос ответить просто - три овцы, которые были рождены в прошедшем году и до сих пор живы. Две (Купид и Диана) из них имеют ген, позволяющий им создавать молоко с таковыми же белками, как и у человека. Третья не имеет измененного генома и просто является контрольным экземпляром.

Из 80 зародышей, как я уже упоминал, выжило лишь три. Ученые связывают таковой отсев не с генетическими модификациями овечек, а с теми же сложностями при клонировании.

Что удалось шотландским ученым и как?

Вообще-то внедрение "чужеродных" генов в ДНК животных - не уникальность. Не уникальность - даже внедрение их в половые клеточки до осеменения. Но это не дозволяет необходимым признакам сохраниться в ребенке. В противоположность этим работам, шотландским ученым удалось выработать методику внедрения чужеродных генов в клеточку овцы до её пересадки в яйцеклетку овцы-донора и последующего получения чёткой копии существа с подходящими качествами.

Был внедрен ген, который благополучно прошел множество проверок и сейчас добавляет в молоко овец "лечебный" фермент, используемый в современной фармакологии для исцеления наследственной эмфиземии - болезни легких. Так что, пейте люди молоко - дышите глубоко...

Директор компании PPL Therapeutics Алан Колман утверждает, что "значение таковой методики заключается в том, что мы сейчас можем выбирать еще до рождения гены, которые желаем изменить либо удалить".

Чем нам это свершение грозит?

Улучшенными качествами клонов.

Клонами со качествами, полезными для человека.

Возможностью растить для пересадки человеческие органы внутри, к примеру, свиней. Причем, по заданным характеристикам и с меньшей вероятностью отторжения. Ученые планируют получить генетически модифицированные копии свиней уже в следующем году.

Клонированные поросята.

В марте 2000 г., Всё та же PPL Therapeutics объявила о том, что в их исследовательском центре родились пять клонированных поросят.

Клонирование свиньи более сложная операция, чем клонирование овец либо скотин, так как для того, чтоб поддерживать одну беременность нужно несколько здоровых плодов. Органы свиньи более подходят к человеку по размерам. Свиньи просто плодятся и известны собственной неприхотливостью. Но самой большой неувязкой остается отторжение органа животного, который человеческий организм не воспринимает за свой. Конкретно в этом направлении будут развиваться дальнейшие исследования ученых из Розлин Института. Ученые видят один из вероятных путей решения данной трудности в том, чтоб генетически "замаскировать" органы животного, для того, чтоб человеческий организм не мог распознать их как чужие. Внимание ученых сосредоточено на исследовании гена под заглавием "alpha 1-3 gal transferase", который ответственен за отторжение чужеродных тканей иммунной системой человека.

Еще одной темой для исследования является попытка "очеловечить" генетическим методом органы свиньи, для того чтоб существенно понизить риск отторжения. Для этого предполагается вводить человеческие гены в хромосомы клонируемых свиней.

Той же задачей, но без внедрения клонирования, занимаются и остальные университеты. К примеру, компания "Imutran", расположенная в Кембридже, смогла получить целое стадо свиней, в генетическом наборе которых уже отсутствует одна из ключевых черт, ответственная за отторжение чужеродных тканей. Как лишь будет получена пара мужской и женской особи, они будут готовы создавать на свет "генетически незапятнанное потомство", с органами, которые можно будет употреблять для трансплантации.

Да... Совершенно забыл сказать - клонировать человека пока никто не сумел. И дело тут не в отличии его от овцы. Просто не достаточно кто решится экспериментировать с 80 эмбрионами человека, чтоб позже получить трех шестимесячных младенцев. Проще растить нужные для нас органы во чреве свиньи

Клонирование человеческих зародышей.

Уже в сентябре на родине овцы Долли может быть клонирован первый человеческий эмбрион. Правительство Великобритании обязано официально озвучить свою позицию по проблеме "терапевтического" клонирования человеческих существ. Речь идет о разработке ранешних зародышей - собственного рода банка донорских тканей для конкретных индивидуумов.

Стволовые клеточки (упрощенно - клеточки ранешних человеческих эмбрионов) давно находятся в центре внимания медицины из-за собственных неповторимых особенностей. В этих клеточках еще работают первобытно-массивные загадочные гены, которые навсегда "умолкают" в клеточках взрослого человека. Потенциал роста стволовых клеток просто умопомрачительный - довольно вспомнить, что триллионноклеточный организм новорожденного человека появляется из одной-единственной клеточки всего только за 9 месяцев! Но еще больше впечатляет потенциал дифференцировки - одна и та же стволовая клеточка может трансформироваться в всякую(!) клеточку человека, будь то нейрон головного мозга, клеточка печени либо сердечный миоцит. "Взрослым" клеточкам таковая трансформация не по силам.

Еще одно свойство этих клеток превращает их в поистине бесценный объект для медицины. "Чужие" стволовые клеточки, введенные в организм человека, отторгаются еще слабее, чем пересаженные целые органы, состоящие из уже дифференцированных клеток. Это значит, что в принципе можно растить в лабораторных условиях предшественники самых различных клеток (сердечных, нервных, печеночных, иммунных и др.), И потом трансплантировать их тяжело больным людям заместо донорских органов

перечень литературы

Для подготовки данной работы были использованы материалы с сайта http://learnbiology.narod.ru


 
Еще рефераты и курсовые из раздела
Возрастная анатомия, физиология и гигиена
Оглавление. 1.Система пищеварения. 1 1.1.Антенатальный период. 1 1.2.Постнатальный период. 2 2.Пищеварение в полости рта. 3 3.Пищеварение в желудке....

Базы естествознания
базы естествознания Естественно - научная картина мира. Научная картина мира это – множество теорий в совокупности описывающих   известный человеку природный мир,...

Бром
БРОМ (лат. Bromum), Br - химический эле­мент VII группы периодической системы Мен­делеева, относится к галогенам, атомный номер 35, атомная масса 79,904; красно-бурая жид­кость с...

Многофункциональность кожного покрова амфибий
Многофункциональность кожного покрова амфибий Жданова Т. Д. Из учебной литературы понятно, что кожа у земноводных голая, богата железами, которые выделяют много слизи. Эта...

Роль биологии в наши дни
Реферат: Практическое значение биологии. Роль бионики для человека Биомеханика - одно из направлений бионики, специализирующееся на исследовании морфологических особенностей живых...